前言
气单胞菌属作为一种条件致病菌，引起的细菌侵染不仅影响了水产养殖业的经济基础，还可通过水产品和水生动物感染人畜，轻者导致人畜腹泻，重者食物中毒甚至是败血症，严重影响人类以及牲畜健康。细菌性鱼类疾病通常用抗生素治疗，而抗生素的长期使用会导致细菌耐药。耐药菌的发展和传播与环境中的抗菌素残留相结合，而人类可以通过环境接触或食物链接触耐药菌，这就成为了公共健康问题。
黑水虻（Hermetia illucens）幼虫在水产饲料生产中具有很好的经济前景。从营养的角度来说，黑水虻含有大量的蛋白质和脂质（分别为 307.5–588.0 g/Kg 和 113.0–386.0 g/Kg）。在脂肪酸谱方面，黑水虻通常富含饱和脂肪酸 (SFA)，而缺乏多元不饱和脂肪酸 (PUFA)。最近的几项研究发现，幼虫血淋巴和蛆提取物以及分泌物的抗菌活性有望用于开发新的具有治疗价值的抗菌剂，特别是在防御多重耐药“超级细菌”方面。据报道，来自黑水虻脂肪的不饱和油酸 (18:1, n-9) 和亚油酸 (18:2, n-6) 具有很高的营养价值。此外，黑水虻脂肪富含中链月桂酸，其对破坏细菌细胞膜具有抗菌活性。黑水虻幼虫脂肪的酸性水-甲醇提取物 (AWME) 对当代植物病原体也具有抗菌潜力。
本研究旨在比较对黑水虻脂肪连续萃取物的组成和抗菌特性。在鱼类病原体中，嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌对不同标准抗生素均表现出多重耐药性 (MDR)。本研究首次证明了连续萃取物对气单胞菌菌的高剂量依赖性抗菌活性，尤其是多重耐药性杀鲑气单胞菌。通过连续萃取，萃取物的抑菌和杀菌 (MIC/MBC) 活性显着增强。第三次连续萃取物 (AWME3) 对气单胞菌属具有最高抗菌活性。因此，黑水虻的幼虫脂肪可以作为一种极好的生物活性分子库，其具有良好的根除多重耐药细菌的能力，在水产养殖领域具有实际应用潜力。
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方法
实验使用脂肪分离自机械压榨机压紧的 15 天龄的活的黑水虻幼虫。使用酸性水-甲醇溶液对黑水虻脂肪进行连续萃取。即，将压缩的黑水虻幼虫在提取溶液中热处理后进行剧烈的漩涡。在室温下连续提取 24 小时后，将混合物超声处理后剧烈均质，最后离心以分离不溶性脂肪。以上步骤连续进行三轮。最后，所有提取物真空浓缩后储存直至使用。
在 Muller-Hinton 琼脂中使用圆片扩散试验测定了嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的抗生素敏感性，计算了每个菌株的多重耐药性（MDR）指数。在 Mueller-Hinton 琼脂平板上，通过测量抑菌圈的直径测定每个连续萃取物（AWME1、AWME2 和 AWME3）的抗菌活性。通过微量稀释测定方法确定最小抑制浓度 (MIC)。基于AWME3 和抗菌剂 (DOX)分别处理后不同时间点测定半抑制浓度（MIC50），通过比浊测定法测定并绘制测试菌株的生长曲线。
使用气相色谱仪分析对黑水虻脂肪的连续萃取物。通过与美国国家标准与技术研究院 (NIST) 库中存储的真实化合物的光谱数据库进行保留时间 (min)、峰面积、峰高和质谱图的比较，确定了色谱峰与NIST-8 库相似指数 (SI) ≥70% 匹配的化合物。
对实验数据使用重复测量的双向方差分析（Two‐way RM‐ANOVA）进行统计分析，以确定处理之间的显着统计差异。
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结果
图2 由圆盘扩散实验确定的嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌对三次连续提取物的敏感性。
(a) AWME1 (Ex#1) 和 AWME2 (Ex.#2) (b) AWME3 (Ex.#3) 和三次萃取混合物（MIX）；(c) 阳性对照和阴性对照。
图3 嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌对三次连续提取物的敏感性。
数据表明，顺序提取程序逐渐增强了萃取物对致病性鱼类细菌的抗菌活性。
图4 通过圆盘扩散试验验确定的嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌对第三次萃取物（AWME3） 的剂量依赖敏感性。
(a,b) 在孵育 12 小时和 24 小时后的不同剂量AWME3 组的IZD；(c) 在孵育 12 小时和 24 小时后的阳性对照和阴性对照的IZD。
图5 和杀鲑气单胞菌对第三次萃取物（AWME3） 的剂量依赖敏感性。
在孵育 12 小时和 24 小时后，嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌均受到第三次萃取物（AWME3）抑制。并且，从它们的抑菌圈大小中观察到了嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌对第三次萃取物（AWME3）的剂量依赖敏感性。值得注意的是，杀鲑气单胞菌比嗜水气单胞菌对第三次萃取物（AWME3） 更敏感。
图6 分别用强力霉素（DOX）第三次萃取物（AWME3） 处理的鱼类病原菌的半抑制浓度MIC50。用 (a) 多西环素 (DOX) 和 (b) 第三次萃取物（AWME3）处理的嗜水气单胞菌；用（c）强力霉素（DOX）和（d）第三次萃取物（AWME3）处理的杀鲑气单胞菌。
半抑制浓度 (MIC50)表示测试群体中≥50% 的菌株被抑制时的 MIC 值。MIC50值的比较表明，杀鲑气单胞菌株对 DOX 的耐药性始终高于嗜水气单胞菌株。相比之下，在任意时间点，两种菌株对第三次萃取物（AWME3）的敏感性差异较小（MIC50 值仅相差 2-3 倍）。
图7 显示了第三次萃取物（AWME3）和强力霉素（DOX）对嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌培养24 小时内菌群内活细胞数量的影响。
在第三次萃取物（AWME3）浓度≤24 μg/mL 的情况下，嗜水气单胞菌生长的滞后期延长至 4 小时，而在 DOX 浓度≤0.125 μg/mL 的情况下，仅延长两小时。用浓度≤190 μg/mL 的第三次萃取物（AWME3）和浓度≤0.78 μg/mL 的DOX 处理杀鲑气单胞菌的滞后期为2 小时。在第三次萃取物（AWME3）浓度≥190 μg/mL 和 DOX 浓度≥0.250 μg/mL 的处理下，嗜水气单胞菌没有出现对数生长期，而对于杀鲑气单胞菌在 第三次萃取物（AWME3）和 DOX 处理下不生长的浓度分别为≥380 μg/mL 和≥6.25 μg/mL。
这些结果表明，提取自黑水虻幼虫脂肪的 第三次萃取物（AWME3）早在孵育 6 小时就可以预防和持续抑制鱼类病原体的增殖和生长，包括耐抗生素的杀鲑气单胞菌，因此有可能用作抗菌剂。
图7 用不同浓度的第三次萃取物（AWME3）或 DOX 处理的菌株生长曲线。
(a,b) 嗜水气单胞菌 (c,d) 杀鲑气单胞菌
黑水虻幼虫脂肪连续萃取后主要成分是游离脂肪酸（FFA）和其衍生物。在 FFA 中，与不饱和脂肪酸 (USFA) 相比，饱和脂肪酸 (SFA) 的含量占浓度的两倍。AWME1、AWME2和AWME3中SFAs的含量分别为59.2%、51.09%和51.32%，而USFAs的含量分别26.05%、27.42%和29.64%。主要的FFAs是n‐十六烷酸(棕榈酸)，八烷酸‐9‐酸(油酸)，十二烷酸(月桂酸)，十四烷酸(肉豆蔻酸)和十八烷酸(硬脂酸)。与其他阶段的萃取物相比，AWME3 作为抑制致病性鱼类细菌的最有效抗菌剂富含顺式油酸 (C18:1, 26.28%)和甘油。GC-MS 结果表明，在从黑水虻幼虫脂肪中提取的其他阶段萃取物成分中，AWME3 具有最多的 USFA、顺式双键化合物和甘油，这表明它抗菌效果最佳。
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结论
本研究通过改进提取工艺，使用酸性水-甲醇溶液对黑水虻幼虫脂肪进行连续三次萃取。抗菌药物敏感性试验表明，每一种萃取物对重要的鱼类致病性细菌嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌，特别是耐药杀鲑气单胞菌的抗菌活性都具有高剂量依赖性。此外，通过改进的萃取程序，可以逐渐丰富不饱和脂肪酸(USFAs)在萃取物中的含量，因而其抗菌活性得以不断提高。
由此可见，黑水虻幼虫脂肪是良好的生物活性分子库，具有杀灭细菌甚至耐药菌的能力，因此在水产养殖领域具有很好的实际应用潜力，可作为抗生素的替代品。
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“凤凰虫” 虫浆
纯黑水虻幼虫加工
富含脂肪酸、抗菌肽
增强水产免疫
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感谢原文作者的研究与分享：
Mohamed, H.; Marusich,E.; Afanasev, Y.; Leonov, S. Fatty Acids-Enriched Fractions of Hermetia illucens (Black Soldier Fly) Larvae Fat Can Combat MDR Pathogenic Fish Bacteria Aeromonas spp. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 8829. https://doi.org/10.3390/ijms22168829
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